Убиквитинлигаза COP1 Е3 регулирует термосенсорное цветение, вызывая деградацию желудочно-кишечного тракта у арабидопсиса

1. мутанты cop1 нечувствительны к изменениям температуры окружающей среды при цветении Сигнализация...
2. Стабильность COP1 контролируется температурой окружающей среды
3. Цветочный переход при низкой температуре окружающей среды частично регулируется модулем COP1-GI

мутанты cop1 нечувствительны к изменениям температуры окружающей среды при цветении

Сигнализация температуры окружающей среды тесно связана с фотопериодной сигнализацией. 7 , 17 , 22 , 23 , В предварительной попытке исследовать световые и температурные перекрестные помехи мы оценили световые сигнальные мутанты на предмет их чувствительности к низкой температуре окружающей среды. Из исследованных светосигнальных мутантов мутант cop1-6 с нарушением COP1 показал пониженную чувствительность к изменениям температуры окружающей среды в условиях длинного дня (LD). Цветение растений дикого типа (Col-0) было существенно задержано при 16 ° C с соотношением времени цветения (16 ° C / 23 ° C) примерно 2,7 ( Рис. 1а, б ), что соответствовало предыдущим наблюдениям 4 , Однако, мутант cop1-6 показал раннее цветение независимо от температуры окружающей среды, с соотношением времени цветения приблизительно 1,3 ( Рис. 1а, б ).

Рисунок 1: cop1–6 нечувствителен к низкой температуре окружающей среды.

( а ) Цветущие фенотипы cop1–6 . Растения выращивали в течение 7 недель при 23 ° C или при 16 ° C в условиях длинного дня (LD). Шкала бар = 1 см. ( b ) Время цветения cop1–6 и cop1–4 при 23 ° C и 16 ° C. Время цветения измеряли путем подсчета общего количества листьев розетки в начале цветения. Три биологических повторения были усреднены, и статистически значимые различия между значениями каждого генотипа при 23 ° C и 16 ° C отмечены звездочками ( t- критерий Стьюдента, ** P <0,01; * P <0,05). Столбцы указывают стандартную ошибку среднего. Числа над столбиками указывают соотношение цветения при 16 ° C и 23 ° C (16 ° C / 23 ° C).

Чтобы определить роль COP1 в термосенсорном цветении, мы получили дополнительный мутант cop1-4 и измерили время цветения в различных температурных условиях. 21 , у мутанта cop1–4 выявлено значительное снижение чувствительности к низкой температуре окружающей среды, аналогичное мутанту cop1–6 ( Рис. 1б ), предполагая, что COP1 участвует в температурном переходе, зависящем от температуры окружающей среды. Незначительные различия cop1–4 и cop1–6 в температурной чувствительности могут быть связаны с аллельными вариациями 20 , Из-за его сильных фенотипов мы использовали мутанта cop1–6 для последующих анализов.

FT требуется для действия COP1

Сигналы температуры окружающей среды интегрируются в интегратор цветения FT , и, таким образом, мы затем изучили, влияет ли COP1 на экспрессию FT для достижения правильной реакции развития на температуры окружающей среды.

Экспрессия FT была существенно подавлена ​​при низких температурах у растений дикого типа с соотношением (16 ° C / 23 ° C) 0,2, тогда как зависящие от температуры изменения в экспрессии FT были значительно снижены у мутанта cop1-6 ( Рис. 2а ). SOC1 является еще одним цветущим интегратором, который действует частично ниже FT 24 , Чтобы проверить, была ли измененная экспрессия FT существенной для пути цветения, мы проанализировали экспрессию SOC1 . Подобно экспрессии FT , накопление транскрипта SOC1 также снижалось у растений дикого типа при низкой температуре окружающей среды, но изменение было значительно снижено у мутанта cop1-6 ( Рис. 2б ).

Относительную экспрессию FT ( a ) и SOC1 ( b ) в течение времени Zeitgeber (ZT) 16 анализировали с помощью RT-КПЦР. Двенадцатидневные саженцы, выращенные под LD, использовали для анализа накопления транскрипта. Столбцы указывают стандартную ошибку среднего. Числа над столбиками указывают соотношение выражений при 16 ° C и 23 ° C (16 ° C / 23 ° C). ( c ) Время цветения cop1-6 , ft-10 и cop1–6 ft-10 при 23 ° C и 16 ° C. Время цветения измеряли путем подсчета общего количества листьев розетки в начале цветения. Три биологических повторения были усреднены, и статистически значимые различия между значениями каждого генотипа при 23 ° C и 16 ° C отмечены звездочками ( t- критерий Стьюдента, ** P <0,01; * P <0,05). Столбцы указывают стандартную ошибку среднего. Числа над столбиками указывают соотношение выражений при 16 ° C и 23 ° C (16 ° C / 23 ° C).

Чтобы дополнительно оценить генетическую иерархию между FT и COP1 , мы пересекли ft-10 с cop1–6 . Хотя фенотипы роста замедлились Рис. S1 ), фенотип цветения двойного мутанта cop1-6 фут-10 был сопоставим с фенотипом ft-10 независимо от температуры окружающей среды ( Рис. 2с ), что указывает на то, что FT действует ниже COP1 по термосенсорному пути.

Стабильность COP1 контролируется температурой окружающей среды

Затем мы спросили, как COP1 воспринимает сигналы температуры окружающей среды. Для этого мы измерили накопление транскрипта COP1 в проростках, выращенных при разных температурах окружающей среды. Низкая температура приводила к снижению накопления транскрипта COP1 , тогда как экспрессия COP1 не изменялась при высоких температурах ( Рис. S2 ). Поскольку снижение экспрессии COP1 не может объяснить фенотип раннего цветения мутанта cop1-6 при низких температурах, можно считать, что экспрессия COP1 может быть связана с регуляцией обратной связи накопления белка. Вполне вероятно, что при низкой температуре окружающей среды транскрипция COP1 снижается для поддержания гомеостаза для повышенных уровней COP1.

Чтобы проверить эту гипотезу, мы использовали трансгенные растения 35S: COP1-TAP 21 выращивается при разных температурах окружающей среды. Примечательно, что уровни белка COP1 значительно повышались при низкой температуре по сравнению с его уровнями при 23 ° C ( Рис. 3а ). Влияние температуры на накопление COP1 наблюдалось как в светлое, так и в темное время суток, в то время как оно было более выраженным в темноте ( Рис. 3б ). Стабильность COP1, по-видимому, контролируется множеством факторов окружающей среды, включая свет и температуру, и различные схемы деградации COP1 могут быть обусловлены различными разрушительными механизмами в зависимости от окружающей среды.

( a ) Накопление COP1 при различных температурах окружающей среды. Двенадцатидневные саженцы 35S: COP1-TAP, выращенные при 23 ° С или 16 ° С, собирали в конце ночи (ZT24) для иммуноблот-анализа. Чтобы свести к минимуму вторичные эффекты, вызванные разницей в скорости роста, 10-дневные саженцы, выращенные при 16 ° С или 23 ° С в условиях ЛД, переносили в разные температуры окружающей среды и инкубировали в течение 2 дней. ( b ) Накопление COP1 при 16 ° C в светлых и темных условиях. Двенадцатидневные саженцы, выращенные под LD, собирали в ZT20 или ZT4. Белки COP1-TAP (стрелки) определяли иммунологически с использованием антитела против MYC. Низкомолекулярные полосы (стрелки) могут быть продуктами распада. Часть окрашенного Кумасси синим геля ( C ) показана в качестве контроля загрузки. Полосы из трех пятен были определены количественно с использованием программного обеспечения Image J и усреднены (правые панели).

Чтобы свести к минимуму вторичный эффект, вызванный снижением скорости роста при низкой температуре, мы перенесли растения, выращенные при 23 ° С, до 16 ° С и наоборот и инкубировали их в течение 2 дней ( Рис. 3а ). Кратковременное воздействие низкой температуры также стимулировало накопление COP1. Напротив, деградация COP1 не изменилась при высокой температуре ( Рис. S3 ), что указывает на то, что стабильность COP1 в первую очередь регулируется низкой температурой окружающей среды.

Цветочный переход при низкой температуре окружающей среды частично регулируется модулем COP1-GI

CO является репрезентативной протеолитической мишенью для COP1, и поэтому мы проверили, регулируется ли активность CO температурой окружающей среды. Тем не менее, транскрипт и накопление белка CO были в значительной степени независимы от изменений температуры окружающей среды ( Рис. S4 и S5 ). Кроме того, ранее было продемонстрировано, что неправильная экспрессия СО не влияет на температурную чувствительность при цветочном переходе. 4 , 25 , предполагая, что СО не является компонентом термосенсорного пути.

COP1 также участвует в регуляции стабильности GI наряду с ELF3 21 , Поэтому мы исследовали, регулирует ли COP1 белковый обмен GI при низких температурах. Для этого мы использовали трансгенные растения 35S: GI-HA 26 выращен при различных температурах окружающей среды для мониторинга накопления GI. Стабильность белка GI заметно снижалась при 16 ° С по сравнению со стабильностью при 23 ° С ( Рис. 4а ), и уменьшенное накопление белка было восстановлено обработкой MG132, сильным ингибитором протеасомы 26S ( Рис. 4б ), предполагая, что процесс убиквитинирования лежит в основе температурно-зависимого накопления GI. Для дальнейшей поддержки роли COP1 в обмене GI при низкой температуре трансгенные растения 35S: GI-HA скрещивали с мутантом cop1-6 . У растений 35S: GI-HA cop1–6 накопление GI было повышенным по сравнению с растениями 35S: GI-HA и не было чувствительным к изменениям температуры окружающей среды ( Рис. 4с ), что указывает на то, что COP1 является однозначным регулятором оборота ЖКТ при низкой температуре.

Двенадцатидневные саженцы 35S: GI-HA, выращенные при 23 ° С или 16 ° С в условиях ЛД, собирали в ZT24. Белки GI-HA (стрелки) определяли иммунологически с использованием антитела против HA. Часть окрашенного Кумасси синим геля ( C ) показана в качестве контроля нагрузки. ( а ) GI накопление при 23 ° С и 16 ° С. ( б ) Влияние MG132 на стабильность ЖКТ. ( c ) Оборот желудочно-кишечного тракта при низкой температуре в коп . 1-6 . Полосы из трех пятен были количественно определены с использованием программного обеспечения Image J и усреднены. Статистическую значимость измерений определяли по t- критерию Стьюдента (* P <0,05) или односторонней анове с специальным тестом Фишера ( P <0,05). Числа над столбиками указывают соотношение выражений при 16 ° C и 23 ° C (16 ° C / 23 ° C).

Адаптерный белок ELF3 также протеолитически расщепляется COP1, чтобы контролировать обмен GI 21 , Однако протеолиз ELF3 не был повышен при низких температурах ( Рис. S6 ), хотя оказалось, что ELF3 необходим для правильного реагирования на изменения температуры окружающей среды ( Рис. S7 и S8 ) 7 , Различные молекулярные механизмы, вероятно, лежат в основе регуляции активности ELF3 при разных температурах окружающей среды (см. Обсуждение).

GI связывается непосредственно с промоутером FT 27 , Таким образом, мы исследовали, регулируется ли связывание GI с промотором FT температурой окружающей среды. Трансгенные растения 35S: GI-HA выращивали при 23 ° С и 16 ° С. Общие белковые экстракты из контрольных и 35S: GI-HA трансгенных растений иммуноосаждали антителом против HA. ДНК, связанную с меченными эпитопом белками GI, анализировали с помощью количественных анализов ПЦР (КПЦР). Анализ ChIP показал, что промотор FT был обогащен GI ( Рис. 5а ) как сообщалось ранее 27 , Однако ассоциация GI с промотором FT была существенно снижена при низкой температуре, возможно, из-за снижения стабильности белка GI ( Рис. 5а ). Снижение связывания GI с промотором FT при низкой температуре было нарушено у мутанта cop1-6 ( Рис. 5б ). Чтобы еще больше убедить это наблюдение, мы проанализировали экспрессию FT в мутанте gi-2 при низкой температуре окружающей среды. В то время как экспрессия FT была существенно снижена при 16 ° C на фоне дикого типа, конститутивно сниженная экспрессия FT наблюдалась у мутанта gi-2 независимо от температуры окружающей среды ( Рис. 5с ), что указывает на значительную роль модуля COP1-GI в термосенсорном цветении.

Рисунок 5: Ассоциация GI с промотором FT зависит от температуры окружающей среды.

( а ) ЧИП-анализы. Показаны пять ампликонов КПЦР на промоторе FT . Двенадцатидневные растения 35S: GI-HA, выращенные при 23 ° C или 16 ° C под LD, собирали в ZT24 для анализа ChIP. Статистическую значимость измерений определяли по t- критерию Стьюдента (* P <0,05). ( б ) ChIP-анализ GI-связывания с FT в cop1-6 при ZT24. Разные буквы представляют значительную разницу при P <0,05 (односторонняя анова с помощью специального теста Фишера). Числа над столбиками указывают соотношение экспрессии при 16 ° С и 23 ° С в каждом генотипе (16 ° С / 23 ° С). ( c ) Относительная экспрессия FT в gi-2 при 23 ° C и 16 ° C. Двенадцатидневные саженцы, выращенные под LD, собирали в ZT16 для анализа накопления транскрипта. Столбцы указывают стандартную ошибку среднего. Числа над столбиками указывают соотношение выражений при 16 ° C и 23 ° C (16 ° C / 23 ° C).

Чтобы подтвердить генетическую связь между GI и COP1 , мы скрещивались между gi-2 и cop1-6 мутантами. При нормальных условиях роста время цветения мутанта gi-2 cop1-6 было сравнимо с временем мутации gi-2 ( Рис. 6а ). Кроме того, чувствительность к температуре мутантов gi-2 cop1–6 и gi-2 также была сопоставимой, что указывает на то, что они действуют по одному и тому же генетическому пути.

( а ) Время цветения мутантов и трансгенных растений. Время цветения измеряли путем подсчета общего количества листьев розетки в начале цветения. Три биологических повторения были усреднены, и статистически значимые различия между значениями при 23 ° C и 16 ° C отмечены звездочками ( t- критерий Стьюдента, ** P <0,01; * P <0,05). Столбцы указывают стандартную ошибку среднего. Числа над столбиками указывают соотношение цветения при 16 ° C и 23 ° C (16 ° C / 23 ° C). ( б ) Рабочая схема COP1-опосредованного термосенсорного цветения. Накопление COP1 при низкой температуре вызывает деградацию желудочно-кишечного тракта. Таким образом, связывание GI с промотором FT снижается, и цветочный переход задерживается независимым от СО образом.

В совокупности COP1 является центральным регулятором, который объединяет фотопериод и температурную сигнализацию. В дополнение к своей фотопериодической регуляции СО, COP1 также регулирует температурно-зависимую стабильность желудочно-кишечного тракта ( Рис. 6б ). При низкой температуре COP1 стабилизируется и вызывает деградацию желудочно-кишечного тракта даже в условиях индуктивного LD. Стабильность COP1, регулируемая как фотопериодом, так и температурой окружающей среды, помогает принимать интегративные решения для определения сроков цветения, а условная специфичность COP1 к его целям обеспечивает надлежащие переходные процессы развития у растений.

Похожие

Комментарии