Обнаружение распространенных азиатских вариантов числа копий с использованием интегрированного массива высокого разрешения CGH и массивно-параллельного секвенирования ДНК

Крупномасштабные инициативы по секвенированию отдельных геномов направлены на выявление широкого спектра генетических вариантов, от SNP до структурных геномных вариантов (включая CNV). 1 , чтобы определить генетические факторы, которые способствуют фенотипу человека. Тем не менее, современные стратегии секвенирования ДНК приводят к короткому чтению (в паре или не в паре), что накладывает существенные ограничения на точное определение структурных геномных вариантов. Здесь мы разработали интегрированную стратегию для объединения информации CGH (aCGH) массива высокого разрешения с данными секвенирования всего генома, чтобы всесторонне идентифицировать и охарактеризовать общие CNV в трех азиатских популяциях.

Мы применили эту стратегию к геномной ДНК 30 азиатских женщин (десять корейцев (KOR), десять китайцев HapMap (CHB) и десять японцев HapMap (JPT)), чтобы разработать точную и всеобъемлющую общую карту CNV для азиатских популяций, которая будет дополнять недавно опубликованная карта CNV для населения Западной Африки и Европы 2 , Геномную ДНК всех 30 человек применяли к специально разработанной платформе aCGH, включающей 24 миллиона олигонуклеотидных зондов ( Дополнительный рис. 1 ). Эмпирически было определено, что платформа имеет эффективное разрешение для обнаружения CNV всего 438 п.н. Эталонным источником ДНК для наших экспериментов с aCGH в этом исследовании был контрольный индивид (NA10851), использовавшийся в предыдущих исследованиях открытия CNV. 3 , 4 , 5 ( рисунок 1 ). По нашим оценкам, изучение 30 человек обеспечило бы 95,4% мощности для обнаружения CNV с незначительной частотой аллелей 5% среди азиатских популяций.

Рисунок 1: Обзор проекта по обнаружению CNV для азиатского населения.

Геномная ДНК от десяти индейцев алтайского Кореи, десяти особей CHB HapMap китайского происхождения, десяти особей JPT HapMap с японским происхождением и трех индивидуумов с контрольным ресурсом платформы (AK1, NA12878 и NA19240) использовалась для экспериментов cCGH. Данные последовательности генома от трех субъектов (AK1, AK2 и NA10851) были использованы для фильтрации ложноположительных вызовов CNV и для получения абсолютных вызовов CNV.

Среди 30 исследованных азиатских особей мы обнаружили 251 573 предполагаемых сегмента CNV. В целях алгоритмического обучения мы затем провели эксперименты cCGH на ДНК корейского мужчины AK1, для которого данные о секвенировании всего генома уже были доступны при 27,8-кратном охвате. 5 ДНК ДНК корейской женщины AK2, чей геном мы секвенировали с 32-кратным охватом (данные не показаны, см. URL-адрес ). Поскольку во всех экспериментах aCGH использовался NA10851 в качестве эталонного источника ДНК, мы также секвенировали этого человека с 28,3-кратным охватом (см. URL-адрес ). Используя информацию о глубине считывания от AK1 и NA10851, мы разработали критерии для оптимизации соответствия между aCGH и информацией о секвенировании ДНК. Впоследствии мы использовали эти данные глубины чтения для дальнейшего тестирования и проверки наших критериев фильтрации ( Дополнительные таблицы 1 а также 2 а также Дополнительный рис. 2 ). Отфильтрованные данные включали в себя 21 905 сегментов CNV от 30 азиатских особей. Мы обнаружили, что меньшие CNV (<5 кб) с низким отношением log2 были по большей части удалены на основе наших критериев фильтрации.

Сравнение результатов aCGH по ДНК AK1 и AK2 с информацией о глубине считывания из данных секвенирования целого генома на тех же самых людях позволило предположить, что примерно половина сегментов CNV, которые были идентифицированы в AK1 и AK2 (как имеющие относительный геномный прирост и потери по массиву CGH) фактически имели состояние числа копий 2 у этих лиц и состояние числа копий <2 или> 2 у референтного лица, NA10851 ( Рис. 2а а также Дополнительные рис. 3 а также 4 ). Информация о последовательности чтения из NA10851 показала, что 10,980 из отфильтрованных 21,905 сегментов CNV могли быть ошибочно вызваны, потому что контрольный образец из NA10851 имел значения числа копий, не равные 2 в этих геномных областях ( Рис. 2б а также Дополнительное примечание ). Из 10 980 «неясных» сегментов CNV, в которых NA10851 имел номер копии, отличный от 2, 4970 были определены как имеющие диплоидную копию номер два в тестируемом человеке (NA10851) после того, как мы преобразовали их в состояния абсолютного числа копий и удалили их ( Дополнительный Рис. 4c – e ). Было обнаружено, что оставшиеся 6,010 сегментов CNV имеют разные числа копий по сравнению с предсказанным aCGH ( Рис. 2а ). Мы также определили дополнительные 3164 секретных сегментов CNV, которые были изначально пропущены в экспериментах aCGH из-за того, что они имели идентичные номера копий как в тестовом образце, так и в NA10851 ( Дополнительный Рис. 4f – i ). С помощью этого метода мы получили абсолютные состояния числа копий в общей сложности 20 099 сегментов CNV ( Дополнительная таблица 3 ), в котором 9 174 (3 164 от скрытых вызовов и 6 010 от скрытых вызовов) были исправлены с помощью информации о последовательности глубины чтения для NA10851 ( Рис. 2б ).

Рисунок 2: Оригинальный подход для вызова статуса номера абсолютной копии.

( а ) Справа: в верхней части панели показаны данные aCGH для геномной области на хромосоме 3 в AK1 по сравнению с контрольным образцом, NA10851. На второй панели внизу показана информация о глубине считывания для той же области генома, полученная из данных секвенирования всего генома NA10851. Третья панель внизу представляет собой «исправленный» результат абсолютного количества копий для этой геномной области в AK1 с использованием метода анализа алгоритма абсолютного количества копий, описанного в данном исследовании. Нижняя панель отображает ту же область генома для AK1, используя информацию о глубине чтения, полученную из данных секвенирования всего генома. ( b ) Сравнение между состояниями относительного количества копий и значениями абсолютного количества копий для сегментов CNV до и после поправок для состояний номеров копий NA10851. Из общего числа 21 905 CNV, идентифицированных у 30 азиатских особей с помощью aCGH (то есть по состояниям относительного числа копий), относительные значения числа копий в 10 925 не были затронуты CNV в эталоне NA10851. Из 10 980 «неясных» CNV 4970 были определены как не-CNV по абсолютным вызовам и были исключены из окончательного списка CNV. Дополнительные 3164 CNV, которые считались «скрытыми» CNV и были изначально пропущены экспериментами aCGH, также были идентифицированы алгоритмом вызова состояния абсолютного числа копий.

Это исправление также изменило отношение общего количества потерь и выигрышей от числа копий: 72,6% всех вариантов фактически имели число копий <2 на диплоидную ячейку (потеря числа копий) по сравнению с 44,4% до исправления ( Рис. 3а, б а также Дополнительный Рис. 5 ). Это скорректированное соотношение более совместимо с недавним отчетом Conrad et al . 2 , в котором исследователи получили состояния абсолютного числа копий путем кластеризации данных aCGH из 450 образцов. Средняя длина сегментов CNV с потерями и выигрышами в количестве копий составила 11,8 кб и 30,3 кб соответственно ( Рис. 3б ). В общих областях прирост числа копий регистрировался чаще, чем потери количества копий, что может быть связано с тем, что в этих регионах прирост числа копий с меньшей вероятностью будет вредным и, следовательно, с меньшей вероятностью приведет к штрафу при эволюционном отборе. 6 ,

( a ) Распределение абсолютного выигрыша в количестве копий (номер копии> 2) и убытков (номер копии <2) в 33 лицах. ( б ) Распределение относительного и абсолютного числа копий прибыли и убытков по размеру CNV. Оси x и y представляют соответственно размер и количество сегментов CNV.

Было 20,099 сегментов CNV, в конечном счете идентифицированных в этом исследовании. В среднем, 670 сегментов CNV были обнаружены в каждом изученном азиатском человеке, что покрывало 11,31 Мб общей последовательности ДНК и включало 389 генов RefSeq на человека ( Дополнительная таблица 4 ). Мы случайным образом отобрали 116 элементов CNV и провели 1881 эксперимент с количественной ПЦР (КПЦР) на них. В общей сложности 1717 экспериментов с КПЦР были сопоставлены с нашими данными aCGH, в результате чего прогнозное значение составило 91% ( Дополнительные таблицы 5 а также 6 ).

Для сравнения сегментов CNV между индивидуумами сегменты CNV из этого исследования были объединены в группы, называемые «элементами CNV» (CNVE), основанные на перекрытии сегментов более чем на 50% ( Дополнительный Рис. 6 ). Мы получили абсолютные числа копий для 5 177 азиатских CNVE, со средним размером группы 2 667 п.н. ( Дополнительная таблица 7 ) и охватывает 95,40 Мб (3,32%) эталонного генома человека. Чтобы идентифицировать потенциальные азиатские специфические CNVE, мы сравнили эти 5177 CNVE с 4978 CNVE, недавно идентифицированными Conrad et al . 2 , Хотя эти исследователи обнаружили 56 азиатских специфических CNVE, мы определили 3547 предполагаемых азиатских специфических CNVE, которые не были включены в их набор данных ( Рис. 4а и исх. 2 ).

Рисунок 4: Варианты числа экземпляров предполагаемой азиатской популяции.

( а ) Диаграмма Венна, показывающая подтвержденные предполагаемые азиатские специфические CNVE. Нижняя часть рисунка (синяя) указывает на этническое распределение 4959 CNVE, которые были обнаружены на 42M платформе NimbleGen aCGH и подтверждены с помощью микрочипа генотипирования в том же исследовании. 2 , Верхняя часть рисунка указывает на то, что 3547 из 5177 CNVE, обнаруженных среди 30 азиатских особей в этом исследовании, не достигают перекрытия в 1 п.н. с CNVE, недавно обнаруженного Консорциумом структурной вариации генома. 2 , Консорциум структурных вариаций генома сообщил, что они обнаружили 4978 подтвержденных CNVE, но мы показываем только 4959 из них на этой диаграмме Венна, потому что 19 были неполиморфными. ( b ) Распределение категорий онтологии генов для генов, в которых кодирующие последовательности перекрываются с общими областями получения числа копий (внешний круг) и областями потери числа копий (внутренний круг), выявленными у 30 азиатских субъектов. ( c ) Местоположение CNVE и количество азиатских людей, участвующих (гистограмма, справа). Красный, увеличение числа копий; зеленый, потеря номера копии. Выбранные гены и микроРНК также показаны слева.

CNVE, идентифицированные в нашем исследовании, перекрываются с 2913 генами RefSeq и 1483 генами, присутствующими в базе данных OMIM ( Дополнительные таблицы 7 а также 8 ). Эти CNVE также были ответственны за изменения числа копий 29 микроРНК (miRNA) генов ( Дополнительная таблица 9 ), а также 35 потенциальных слияний генов ( Дополнительная таблица 10 ).

Мы классифицировали гены, перекрывающие общие CNVE, обнаруженные в нашем исследовании, с использованием генной онтологии PANTHER (см. URL-адрес ). Увеличение числа копий имело повышенный уклон к содержанию в генах, имеющих функции, связанные с метаболизмом нуклеиновых кислот и процессами развития. Потери числа копий генов были увеличены для генов, вовлеченных в клеточную адгезию. Было обнаружено, что подмножества генов, участвующих в передаче сигнала, иммунитете и сенсорном восприятии, имеют как выигрыш, так и потерю числа копий, что согласуется с предыдущими результатами, касающимися несинонимичных SNP и полиморфизмов делеции 6 , 7 ( Рис. 4б а также Дополнительная таблица 11 ).

Примечательно, что 2183 из 2913 генов RefSeq, которые мы определили как переменную числа копий среди изученных азиатских особей, по-видимому, не были переменными числа копий в популяциях, исследованных Conrad et al . 2 , Например, CNVs в CLPS , LPA и CEBPB , которые, как сообщалось, участвуют в диабете 2 типа, инфаркте миокарда и раке, соответственно, обнаруживаются с частотой ≥10% среди азиатских популяций, которых нет в Конраде. и др . изучение 2 , 7 , 8 , Некоторые гены, такие как LY9 , CNTN5 и PIK3CA , которые, как сообщается, участвуют в системной волчанке, сердечно-сосудистых заболеваниях и онкогенезе, соответственно 9 , 10 , 11 , 12 впервые были обнаружены переменные числа копий либо в этом исследовании, либо в нашем предыдущем отчете о полной последовательности генома AK1 (ref. 5 ). Примеры генов с CNV показаны в Рисунок 4с а также Таблица 1 ,

Поскольку мы использовали новый подход для вызова состояний абсолютного числа копий, некоторые из наших данных демонстрировали частоту генетических вариаций, отличную от предыдущих отчетов. Например, мы идентифицировали потери числа копий (в частности, потерю одной копии) у 3 из 30 азиатских субъектов в РЗП , тогда как Conrad et al . 2 найдено увеличение числа копий у всех 88 азиатских особей, генотипированных. Удаление в гене, кодирующем RhD, который является одним из антигенов резус-крови, приводит к RhD-отрицательному типу крови, когда обе копии гена удалены 13 , Частота гомозиготной делеции, приводящей к RhD-отрицательному типу крови, составляет от 0,3% до 0,5% у азиатов, что согласуется с нашим наблюдаемым коэффициентом потери одной копии в 10,0% (3 человека из 30). 14 , Примеры других расхождений с данными, полученными из исследования, проведенного Conrad et al . 2 перечислены в Дополнительная таблица 12 , Для разработки наиболее эффективного и точного метода определения генотипов абсолютного числа копий потребуются дальнейшие исследования, сравнивающие и проверяющие различные методы абсолютного вызова, включая используемый здесь.

Поскольку метод, предложенный в этом исследовании, использует информацию о последовательности считывания глубины из NA10851, который является одним из наиболее часто используемых контрольных образцов в aCGH, он должен быть пригоден для других исследований aCGH, которые используют NA10851 в качестве контрольного образца. Один пример, в котором состояния абсолютного числа копий могут быть определены из данных, генерируемых другими платформами aCGH, показан в Дополнительный рисунок 7 , В качестве альтернативы, если в экспериментах aCGH в качестве контрольного образца использовался человек, отличный от NA10851, информация о последовательности глубины чтения для этого человека впоследствии могла бы использоваться для создания алгоритма вызова с абсолютным числом копий для этих исследований.

Мы также разработали пользовательский массив генотипирования CNK 180k и использовали этот массив для одновременного исследования 17 760 CNV в большой азиатской семье, состоящей из 13 особей в течение трех поколений. Используя информацию об относительном количестве копий, несоответствия Менделяна для удаления номеров копий оценивались в размере 6,42%. Используя информацию об абсолютном количестве копий, несоответствия Менделяна при удалении номеров копий снизились до 2,59% ( Дополнительный Рис. 8 ), что, вероятно, ближе к истинному уровню образования CNV de novo в этой резолюции.

Потому что Конрад и соавт . 2 В наборе данных использовалась платформа aCGH, отличная от той, что использовалась здесь, и мы рассмотрели, были ли уникальные CNVE, найденные в нашем исследовании, специфичными для платформы. Существуют некоторые различия между платформой Agilent aCGH, использованной в этом исследовании, и массивом NimbleGen, использованным в предыдущем исследовании Conrad et al . 2 , На платформе Agilent мы использовали исключенные области повторяющихся последовательностей с использованием гомологического фильтра, тогда как 43% зондов NimbleGen находятся в повторяющихся областях ( Дополнительный рис. 1 ). Использование платформы Agilent в этом исследовании привело к тому, что часть генома, анализируемого на CNV, была значительно меньше, а частота ложноположительных результатов была ниже. Платформы Agilent и NimbleGen идентифицировали 722 и 1829 CNV, соответственно, в AK1 ( Дополнительный Рис. 7 ). Четыреста пятьдесят CNV были общими для обеих платформ. Из 1282 CNV, специфичных для массива NimbleGen, 655 находились в областях от умеренных до повторяющихся, тогда как 424 имели отношения log2, которые не соответствовали более строгим критериям фильтра, установленным для массива Agilent. Следовательно, только 203 NimbleGen-специфичных CNV были релевантными в этом сравнении. Дальнейшее сравнение CNV, идентифицированных в NA12878 (из CEU) и NA19240 (из YRI), выявило, что% 60% вызовов в массиве Agilent 24M были общими для Conrad et al . в то время как% 40% звонков были только для нашей платформы ( Рис. 5 а также Дополнительный Рис. 9 ). Взятые вместе, эти сравнения показывают, что% 40% вызовов Agilent 24M CNV могут зависеть от платформы и не будут захвачены массивом NimbleGen 42M. Это говорит о том, что около 60% из 3547 потенциальных азиатских специфических CNVE, используемых здесь, действительно специфичны для азиатской популяции и были пропущены в Conrad et al . 2 из-за нехватки образцов от азиатских людей, используемых в их фазе открытия CNV.

Абсолютные CNV, обнаруженные у двух индивидуумов HapMap (NA12878 и NA19240) в этом исследовании с использованием массива Agilent 24M aCGH, сравнивали с CNV, найденными путем генотипирования микрочипа в данных консорциума геномной структурной вариации. Мы также сравнили CNV от AK1, полученные с помощью микрочипов Agilent 24M и Nimblegen 42M.

Таким образом, мы всесторонне идентифицировали распространенные CNV (малая частота аллелей> 1,7%) среди людей в азиатских популяциях с разрешением, достаточным для обнаружения CNV, всего 438 п.н., с использованием интегрированного подхода высокого разрешения aCGH в сочетании с данными секвенирования следующего поколения. Открытие в нашем исследовании многих новых CNV, несмотря на большое количество предыдущих исследований в этой области, скорее всего, связано с повышенным разрешением и всеобъемлющим характером конструкции нашей платформы aCGH, которая нацелена на более мелкие варианты в сочетании с акцентом на азиатских популяции, которые на сегодняшний день относительно не учитывались в исследованиях CNV 15 , 16 , 17 , 18 , Мы также предоставляем парадигму для крупномасштабных инициатив по секвенированию генома, таких как проект 1000 геномов (см. URL-адрес ), чтобы объединить данные секвенирования ДНК с картированием CNV высокого разрешения через aCGH для более точной идентификации и характеристики CNV в отдельных последовательностях генома. Чтобы более точно применять исследования CNV к персонализированной медицине, генотипирование числа копий не должно основываться на данных относительного числа копий, но должно быть в состоянии идентифицировать состояние абсолютного числа копий у любого конкретного человека. Наши результаты также служат руководством для будущих исследований в области геномной медицины среди населения Азии, особенно в тех, которые выявляют этнические различия в предрасположенности к болезням и реакции на наркотики. 19 , 20 , 21 , 22 , 23 ,

Похожие

Комментарии